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细胞固定技术中原子力显微镜的应用

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发表于 2021-11-3 15:06:00 | 显示全部楼层 |阅读模式

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关于原子力显微镜仪器和方式的总结很多,这里只简单介绍一下。AFM是一种以检测探针和样品之间相互作用为特征的扫描力显微镜,主要由四部分组成:带针尖的微悬臂、压电扫描仪、激光和光电探测器以及反馈控制系统。力敏感弹性微悬臂一端固定,另一端附有小针尖。当针尖扫描固定在压电扫描仪上的样品时,随距离变化的针尖-样品之间的相互作用力会导致微悬臂变形。激光源发出的一束激光照射到微悬臂的背面,并反射到光电探测器上。通过反馈控制系统,可以记录样品的表明形状或样品-针尖之间的作用力。随着原子力显微镜技术的快速发展,它在细菌吸附研究中的应用越来越广泛,主要包括测量细菌表明形态和细菌与固相表明之间的作用力。


                               
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在使用AFM研究细菌吸附时,现有文献中使用了多种固定细菌细胞的方式。根据细菌的固定位置,固定方式可分为两类:第一,细胞固定在支撑物上,探头可以是氮化硅或硅探头,也可以是微米大小珠子的微悬臂。由于均质探头的制作受到材料的限制,研究细菌与不同固相界面之间的相互作用也将受到限制;第二,细胞固定在探头上,即细胞探头。这种固定方式弥补了第一种方式的不足,可用于探索细胞探头与任何感兴趣的固相表明之间的相互作用,但该技术的缺点是细胞探头表明大,成像分辨率低。力测值是探头与研究表明之间微米水平接触区的力效应的平均值,很难获得准确的探头半径和细胞或细胞外大分子的取向。此外,两种细胞固定技术都必要保持细胞的自然状态,细胞的固定力大于细胞和界面之间的力

AFM测定的一个基本要求是样品必须粘附在固体底物上。对于微生物细胞样品,由于其形状明确,在底物上没有展开的趋势,细胞与底物的接触面积很小,扫描探针显微镜经常导致细胞与底物分离。虽然风干细胞可以解决上述问题,但风干处理也会导致细胞表明分子的变性。为了原位固定细菌细胞,许多研究人员使用聚乙烯亚胺、氨基硅烷、多聚-L-赖氨酸或明胶对底物进行预处理,或者直接使用微生物细胞分泌的细胞外聚合物,可以将细胞强烈粘附在底物上。此外,琼脂或微孔膜中的机械固定细胞也可以机械固定。琼脂被用作软变形的固定基质,可用于细胞生长过程中的可视化研究,而微孔聚合物膜可以机械捕获与孔大小相似的球形细胞,允许重复成像而不造成细胞分离或损伤。微孔膜机械捕获技术的优点是简单直接,不涉及化学固定和干燥,缺点是只能固定球形细胞,不能固定。细菌在修饰表明的物理吸附促进了细胞表明结构的重排,戊二醛处理导致细胞表明性质的变化。简而言之,对于一个新的系统,应该评估各种固定技术的优缺点,最合适的方式通常取决于系统的细胞类型和环境条件。


                               
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细胞直接连接到探针后,研究人员可以探测细胞与各种固相表明之间的相互作用。根据现有的研究结果,细胞探针可以分为单细胞探针和多细胞探针。在多细胞探针方面,最初,研究人员直接将戊二醛交联处理后的细菌细胞连接到聚乙烯亚胺包裹的探针上。然而,戊二醛处理可能会影响细胞表明的结构、性质和吸附特性。然而,基于戊二醛处理的细菌的zeta电位和接触角保持不变,认为戊二醛处理不影响大肠杆菌的吸附特性。在研究细菌与矿物的相互作用时,lower建立了生物活性探针的生产方式,即物理方式将细菌吸附在多聚-D-赖氨酸包裹的玻璃珠上,然后通过少量环氧树脂将单层细胞的微珠粘附在微悬臂上。随后的研究发现,1-1-1烷硫醇或多聚-L-L氨酸可以通过直接修饰微悬臂上的针尖将细胞固定在探针上。在单个细胞探针上,虽然现有的真菌探针大小明显大于单个细菌探针,但它不容易粘附在单个细胞上。但作者也认为,这种直接连接技术相当困难,提出光镊或纳米镊子等技术的进步可以显著促进单细胞探针的发展。

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